PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Antes de realizar las prácticas debemos conocer las normas y los instrumentos que vamos a utilizar. Las normas, es uno de los aspectos más importantes del trabajo en el laboratorio, y nos debemos asegurar que las conocemos a la perfección. Conclusión los mayores peligros del laboratorio no son el fuego, los productos tóxicos o las descargas eléctricas , sino el descuido y la falta de responsabilidad.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

El trabajo en el Laboratorio requiere la observación de una serie de normas de de seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo.

1. Dejar siempre las mochilas a la entrada, llevando solo a la mesa el cuaderno y el bolígrafo.

2. Utilizar ropa cómoda, no utilizar bufandas largas ni pañuelos .

3. En el caso de tener el cabello largo es conveniente llevarlo recogido

4. No comer ni beber.

5. Evitar los desplazamientos injustificados, mantener siempre el mismo lugar de trabajo.

6. No tocar nada del material preparado para la práctica hasta que lo indique la profesora

7. No arrojar objetos sólidos a las pilas, para ello están los recipientes de basura.

8. Con el material de vidrio utilizar siempre pinzas a la hora de calentarlo.

9. No tirar objetos calientes (vidrio, cerillas, etc.) a los recipientes de basura donde generalmente hay papeles y otros materiales inflamables.

10. Cuidar siempre que las llaves de los mecheros de gas están cerradas.

11. No cambiar las pipetas, ni cuentagotas del frasco que las contiene.

12. En caso de accidente o rotura de material ,avisar inmediatamente a la profesora

13. No tocar ni oler ni probar  ningún producto químico.

14. Lava tus manos antes de salir del laboratorio.

15. Al finalizar comprueba que todo el material ha quedado limpio y en orden, los

aparatos desconectados. Cierra las llaves del agua y apaga los mecheros.

PICTOGRAMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Un pictograma es un signo dibujado y no lingüístico, que representa figurativamente (de forma más o menos realista) un objeto real, o un significativo.

“Un pictograma debería ser enteramente  comprensible con solo tres miradas.”

“En el diseño de un pictograma deberían  suprimirse todos los detalles superfluos.”

En la actualidad, es entendido como un signo claro y esquemático que sintetiza un mensaje o información sobrepasando la barrera del  lenguaje, y con el objetivo de informar y/o señalizar

Los pictogramas que pueden aparecer en la etiqueta de una sustancia química y su significado.

·         Peligro de corrosión: Estos productos son corrosivos y son, por ejemplo: los que atacan y destruyen los metales y los que queman la piel y/o los ojos en caso de contacto o proyección.

·         Gases a presión: Son gases a presión dentro de un recipiente que pueden: explotar bajo efectos del calor: Gases comprimidos, licuados o disueltos. Los gases licuados refrigerados pueden provocar quemaduras y heridas por frío.

·         Peligro para la salud: Estos productos químicos pueden ser: Tóxicos a grandes dosis. Irritantes para los ojos, nariz, la garganta o la piel.  Pueden causar alergias en la piel (eczema). Pueden causar somnolencia o vértigos.

·         Peligro de explosión: El producto puede explotar en contacto con una llama, una chispa, electricidad estática, por calor, por un choque, fricción … Son por ejemplo: Materiales explosivos, materiales autoreactivos y ciertos peróxidos orgánicos.

·         Peligro de incendio: El producto puede inflamarse: en contacto con una llama, una chispa, electricidad estática. Por efecto del calor, fricción. En contacto con el aire. En contacto con el agua, emiten gases inflamables.

·         Productos comburentes: El producto puede provocar o agravar un incendio o provocar una explosión en presencia de productos inflamables.

·         Peligro para la salud: Estos productos se clasifican en una o más de estas categorías: cancerígenos, mutágenos y tóxicos para la reproducción. Alteran el funcionamiento de ciertos órganos como el hígado, sistema nervioso … Estos efectos tóxicos pueden aparecer con una o varias exposiciones. Causan daños a los pulmones y pueden ser mortales su entran en el tracto respiratorio. Causan alergias respiratorias (asma, por ejemplo). Estos productos pueden ejercer su toxicidad por vía oral, cutánea o por inhalación.

·         Peligro para el medio ambiente: Son productos que pueden causar efectos nocivos sobre los organismos del medio acuático.

Laboratorio virtual: simulador de microscopio online

Vídeo: ¿cómo se inventó el microscopio?

EL MICROSCOPIO ÓPTICO

Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. Se trata de un instrumento óptico que contiene varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. El microscopio óptico puede ser monocular y binocular.

Está conformado por tres sistemas: 
El sistema mecánico está constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes que permiten el movimiento para el enfoque. 
El sistema óptico comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas 
El sistema de iluminación comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar su observación. 

El sistema mecánico: 
BRAZO.-  Donde se debe sujetar, las pinzas, el carro, el tubo del microscopio y el revólver. Sirve para trasladar el microscopio de un lugar a otro. 
PIE.- Proporciona estabilidad y sirve de soporte a todas las partes del microscopio. 
PLATINA.- Pieza metálica, cuadrada, en su centro una abertura circular por la que pasará la luz del sistema de iluminación. Se coloca el portaobjetos a observar.
PINZAS DE SUJECION.- Parte mecánica, para sujetar la preparación. Las pinzas poseen un carro con dos tornillos, que permiten un avance longitudinal y transversal de la preparación. 
TORNILLO MACROMETRICO: Movimiento rápido hacia arriba o hacia abajo de la platina para localizar la imagen a observar. 
TORNILLO MICROMETRICO o de enfoque suave.

REVOLVER.- Parte mecánica de movimiento giratorio de los objetivos. 
TUBO.- Parte mecánica que proporciona sostén a los oculares y objetivos. 

El sistema óptico:
OCULAR.- Capta y amplia la imagen formada en los objetivos. Los microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada. 
OBJETIVOS: Pequeños cilindros colocados en el revólver que proporciona el poder de resolución del microscopio y determinan la cantidad total de aumento. 
Existen 4 tipos: 
1.- La lupa (4 X) que sirve para hacer observaciones a bajo aumento. 
2.- El objetivo (10 X) que se utiliza para localizar la imagen que se va a observar. 
3.- El objetivo (40 X) aumenta la imagen anterior, para poder observar se necesita enfocar el objetivo hasta que aparezca la imagen. 
4.- El objetivo de inmersión (100 X) es un lente especial para observar imágenes tan pequeñas como las bacterias. Y se requiere del aceite de inmersión. 

La parte óptica del microscopio es la que determina el número de aumentos que presenta la imagen observada .El aumento total que permite un microscopio óptico se calcula multiplicando el objetivo por la que producen los oculares. 
Un objetivo de 40x (aumenta 40 veces) y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el resultado final será de 400x, la muestra aumentada 400 veces. 

El sistema iluminación: 
La fuente luminosa consiste en un espejo o una fuente de luz eléctrica que dirige un haz de luz hacia el condensador. 
CONDENSADOR.- Es una lente de gran abertura que permite dirigir la mayor parte de los rayos luminosos en la preparación.
DIAFRAGMA: Existe un diafragma en el condensador, que elimina el exceso de luminosidad para tener una buena iluminación del objeto a observar 
FUENTE DE LUZ.- La muestra microscópica necesita que esté iluminada con luz y cuentan con un foco que da energía eléctrica que dirige sus rayos luminosos hacia el sistema condensador. 

Vídeo sobre las partes del microscopio.

EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO. 

Utiliza una fuente de electrones para observar la muestra y se clasifican en dos: 
1.-De Transmisión lineal porque los electrones atraviesan la muestra y la reflejan en una pantalla fluorescente, aumentando la imagen a unas 200,000 veces más que el ojo humano. 
2.-De Barrido Superficial porque los electrones no atraviesan la muestra, solamente recorren la superficie como si la barrieran, proyectándola en una pantalla de televisión, aumentando la imagen hasta 1,000,000 de veces. 

Microscopio de fluorescencia 
- Se utiliza para observar sustancia fluorescentes denominadas fluoróforos. Una molécula fluorescente es aquella que es capaz de captar radiación electromagnética con una longitud de onda determinada y emitir otra radiación electromagnética con otra longitud de onda diferente, normalmente dentro del espectro de la luz visible. 

Microscopio de contraste de fases 
- Realiza modificaciones en la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparación. 

Vídeo: Alimentos bajo el microscopio.

Observación de células animales y vegetales

Para comenzar a utilizar el microscopio, se observarán células animales y vegetales, y se estudiarán sus diferencias.

Observación de células del epitelio de la mucosa bucal

Este epitelio está constituido por células de un contorno irregular, prácticamente incoloras a la luz blanca, por lo que, para su observación es preciso realizar un proceso previo de tinción, en este caso con azul de metileno, que permitirá observar un citoplasma granulado y un núcleo claramente diferenciado.

Método

1.      Raspar suavemente la cara interior de la mejilla con un palillo, y depositar el contenido en un portaobjetos extendiéndolo con cuidado.

2.      Fijar la muestra a la llama para estabilizar las estructuras y adherirla al porta. Para ello, se pasa la cara inferior del porta por encima de la llama brevemente, con cuidado de no quemar las células.

3.      Añadir 1-2 gotas de azul de metileno sobre las células fijadas y dejar teñir durante 3 minutos.

4.      Lavar suavemente la preparación para eliminar el exceso de colorante. Para ello, colocar el porta en pendiente bajo el grifo y dejar caer lentamente un chorro fino de agua.

5.      Secar la parte inferior del porta y colocar un cubreobjetos.

6.      Observar la preparación

Observación de células de hoja de lirio

Estas células se caracterizan por poseer forma regular debido a una pared celular muy refringente, por lo que nos es preciso su tinción para observarlas. En una hoja se pueden observar células epidérmicas, de forma hexagonal y gran tamaño, incoloras, entre las que se incrustan las células oclusivas que forman los estomas, mucho más pequeñas, de forma arriñonada y con cloroplastos de color verde brillante en su interior. En un segundo plano, se pueden observar células del parénquima en empalizada, tejido fotosintético por excelencia, con forma poligonal y con una gran cantidad de cloroplastos de color verde intenso.

Método

1.      Hacer una incisión transversal superficial con el bisturí en un trozo de hoja de lirio y, tirando de la epidermis, obtener una lámina lo más delgada posible.

2.      Depositar la lámina sobre un portaobjetos, añadir una gota de agua y tapar con un cubreobjetos.

3.      Observar la preparación

Cuestiones

1. ¿Qué diferencias se aprecian entre las células animales y vegetales observadas?¿Cuáles pueden ser generalizables?
2. ¿El azul de metileno es un colorante ácido o básico?¿Por qué?

Observación de plastos de células de tubérculo de patata.

Los plastos son orgánulos típicos de células vegetales. En la parte anterior de la práctica se han observado cloroplastos de células estomáticas y de células parenquimáticas. En este parte se observará la estructura y propiedades de los amiloplastos de patata.

Práctica

Los leucoplastos son orgánulos incoloros, con formas diversas, cuya función es almacenar distintos tipos de sustancias. Los amiloplastos de patata, almacenan almidón que se deposita en capas sucesivas, por lo que poseen forma de concha de mejillón, donde se distingue un punto muy refringente en la punta, llamado hilo (donde se acumula mayoritariamente la amilosa), y unos anillos de crecimiento que en conjunto constituyen la loncilla (donde se acumula la amilopectina). Debido a la presencia de almidón, los amiloplastos se pueden teñir con lugol.

Método

1.      Raspar con el bisturí la superficie de una patata pelada, y extender sobre un portaobjetos una pequeña cantidad del raspado.

2.      Añadir una gota de agua y colocar un cubreobjetos.

3.      Observar al microscopio.

Una vez estudiada la estructura de los amiloplastos

4.      Levantar el cubreobjetos y añadir una gota de lugol (diluido 1/10), volver a colocar el cubreobjetos

5.      Observar la preparación.



IDENTIFICACIÓN DE GLÚCIDOS REDUCTORES

Objetivo: Diferenciar con una prueba de laboratorio sencilla los glúcidos reductores (glucosa, fructosa o lactosa; por ejemplo) de los no reductores (sacarosa o almidón)

Material utilizado

Gradilla, tubos de ensayo, glúcidos a ensayar, agua, pinzas de madera, pipeta, mechero, solución de Fehling A y B.

Procedimiento

En una gradilla colocamos varios tubos de ensayo con 3 mL de disoluciones al 5% de diferentes glúcidos, por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa y almidón. Cada tubo contendrá sólo un tipo de glúcido. Es importante rotular los tubos para recordar de qué molécula se trata.

A cada tubo le añadimos 1 mL de solución de FehlingA y 1 mL de solución de FehlingB.

Con una pinza de madera sujetamos los tubos mientras los calentamos uno a uno, al mechero, hasta que hiervan. Observamos la coloración final de los tubos.

Hidrólisis de la sacarosa

La sacarosa es un disacárido no reductor, por tanto, con reacción de Fehling negativa (permanece azul). Si rompemos el enlace glucosídico que une la glucosa y la fructosa obtendremos dos glúcidos reductores, con reacción positiva. Lo podemos comprobar:

A una disolución de sacarosa le añadimos 10 mL de HCl diluido y la calentamos al mechero durante 5 minutos.

Neutralizamos con 3 mL de solución alcalina.

Repetimos la prueba de Fehling que, después de la hidrólisis realizada, será positiva (color rojo ladrillo).

IDENTIFICACIÓN DE ALMIDÓN

Objetivo

Detectar almidón con reactivo de lugol.

Materiales utilizados

Tubos de ensayo, gradilla, almidón (puede servir patata), solución de glucosa al 5% y lugol.

Procedimiento

En un tubo de ensayo colocamos 3 mL de almidón y agua y en otro 3 mL de una disolución de glucosa u otro glúcido.

Pruebas con alimentos

Algunos alimentos cárnicos, como las salchichas o los fiambres, llevan en su composición fécula de patata o almidón para abaratar los costes de producción.

Añadiendo unas gotas de lugol (en su defecto sirve el desinfectante betadine) a jamón cocido de alta calidad y fiambre más económico detectaremos, por la coloración oscura, la presencia o ausencia de almidón.

 IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS

Objetivo

Detectar con pruebas bioquímicas sencillas la presencia de lípidos.

Materiales utilizados

Gradilla, tubos de ensayo, aceite, glucosa al 5%, mantequilla y reactivo Sudan III.

Procedimiento

En varios tubos de ensayo, en una gradilla, colocamos 3 mL de varias muestras, sin mezclarlas, por ejemplo: aceite, agua, disolución de glucosa al 5% y mantequilla derretida.

A cada tubo de añadimos unas gotas de reactivo Sudan III.

Observamos el color obtenido.

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Objetivo

Utilizar reacciones de identificación de proteínas.

Detectar proteínas mediante una prueba sencilla (prueba de Biuret)

Materiales utilizados

Tubos de ensayo, gradilla, mechero, Pinzas de madera, Ácido nítrico (HNO3) al 20%, Disolución de sulfato cúprico (CuSO4), Disolución de hidróxido sódico (NaOH) al 20% y solución de albúmina al 2%.

FUNDAMENTO TEÓRICO

 A. Reacción Xantoprotéica.

La adición de ácido nítrico concentrado a las proteínas produce un color amarillento en la proteína. El posterior calentamiento acelera este proceso. Esto es debido a la nitración de los anillos de fenilo presentes en algunos aminoácidos de las proteínas, con la formación de nitrocompuestos de color amarillo. De ahí el nombre que recibe la reacción (xanto = amarillo).

Si alcalinizamos (hacemos más básico) el medio, el color amarillo se oscurece dando color anaranjado.

 B. Reacción del biuret.

El biuret es un cuerpo muy simple que puede originarse por la unión de dos moléculas de una diamida, en un medio fuertemente alcalino, con desprendimiento de amoníaco.

 Los enlaces peptídicos de las proteínas en las mismas condiciones producirán el biuret. Para que se produzca en este último caso es necesario que haya al menos dos enlaces peptídicos. El biuret se puede unir, por coordinación, a iones Cu2+ (de color azul en disolución acuosa) presentes en el medio, dando un compuesto coloreado violeta.

Procedimiento

A. Reacción Xantoprotéica.

1. Pon 2 ml de disolución de albúmina en un tubo de ensayo.

2. Añade 1 ml de HNO3 al 20%. Anota las observaciones.

3. Calienta a la llama del mechero el contenido del tubo hasta observar cambios en la coloración.

4. Añadir gotas de la disolución de NaOH hasta observar un nuevo cambio en el color.

 B. Reacción del biuret.

1. Pon 2 ml de disolución de albúmina en un tubo de ensayo.

2. Añade 1 ml de la disolución de NaOH y 3 ó 4 gotas de disolución de CuSO4. Agita bien.

3. Observa y anota los cambios producidos.

EXTRACCIÓN DEL ADN DE LAS CÉLULAS

Objetivo

Utilizar técnicas sencillas para poder extraer el ADN de un tejido animal y confirmar su estructura fibrilar a partir del aspecto.
Confirmar, a partir de la longitud enorme de las fibras, que en el núcleo el ADN se encuentra replegado.

Materiales utilizados
Para la extracción de ADN de hígado de pollo, lavavajillas, sal común (NaCl), agua destilada, líquido limpia lentes, alcohol de 96º, probeta, batidora y microscopio óptico. 

Procedimiento

1. Triturar medio higadito de pollo con la batidora. Al triturar se rompen las membranas celulares y queden los núcleos sueltos. Añadir al triturado, 50 centímetros cúbicos de agua. Remover hasta hacer una especie de papilla o puré.

2. Filtrar varias veces sobre una tela o una doble gasa para separar los restos de tejidos que hayan quedado por romper. Medir el volumen del filtrado con una probeta.

3. Añadir al filtrado un volumen igual de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina.

4. A continuación se añade 1 ml de SDS. (Si no se dispone de este producto puede sustituirse por un detergente de vajillas, tipo Mistol o similar). La acción de este detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN.

5. Añadir mediante una pipeta alcohol de 96º frío (a 0º C) (el volumen que corresponda a la mitad del contenido de la probeta). Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas. En la interfase, precipita el ADN.

6. Introducir una varilla de vidrio y remover siempre en la misma dirección. Sobre la se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.

OBSERVACIÓN DE BACTERIAS DEL YOGUR.   TINCIÓN DE GRAM

Objetivo

Con esta práctica observarás bacterias al microscopio óptico, realizarás la tinción más universal en bacteriología y te familiarizarás con la forma de trabajar en un laboratorio.

Materiales utilizados

Yogur, cristal violeta, lugol, etanol 95%, safranina, mechero de alcohol, portaobjetos y microscopio óptico.

Procedimiento

· Sobre un portaobjetos, en una gota de agua, disuelve una pequeña cantidad de yogur. Añade una pequeña gota de alcohol con el objeto de retirar grasa del yogur y facilitar la observación. Puedes hacerlo también, directamente, con mucosa de la boca.

· Realiza una extensión lo más fina posible de la muestra de yogur. Déjala secar. Así haces un frotis.

· Fija la muestra por calor. Para ello pasa el portaobjetos unas tres veces por la llama del mechero, con la muestra hacia arriba.

· En una cubeta de tinción, cubre la preparación con cristal violeta (primer colorante) durante 3 minutos. Después de este tiempo retira el colorante con agua, teniendo cuidado de no arrastrar la muestra.

· Cubre la muestra con lugol (mordiente) durante 1 minuto. Después retíralo con cuidado con agua.

· Para decolorar gotea etanol al 95% sobre la preparación hasta que no salga color. Lava con agua.

· Cubre la preparación con safranina (segundo colorante o colorante de contraste) durante 2 minutos. Lávala con agua y déjala secar, puedes ayudarte con papel de filtro.  

·Observa la preparación al microcopio óptico con el objetivo de 100 aumentos. Recuerda que necesitas aceite de inmersión. Al finalizar, limpia el objetivo.

·Al finalizar, limpia y ordena la mesa de trabajo y lávate las manos con agua y jabón antes de abandonar el laboratorio.

OBSERVACIÓN DE CÉLULAS EN MITOSIS

Mediante el proceso de mitosis, el núcleo de las células eucariotas se divide, repartiendo de forma equitativa el material genético, previamente duplicado; el citoplasma se dividirá, repartiendo los orgánulos celulares en dos células hijas.

La mitosis posee 4 fases:

-Profase: el material cromosómico se condensa y se hacen visibles los cromosomas. La membrana nuclear y el nucleolo se desorganizan, por lo que el material nuclear ocupa gran parte de la célula.

-Metafase: los cromosomas en el plano ecuatorial de la célula, formando la placa  ecuatorial.

- Anafase: las cromátidas hermanas se separan, cada juego a un polo de la célula.

-Telofase: cada juego de cromosomas, situado en cada polo de la célula se descondesan. Se organiza

la membrana nuclear y el nucleolo.

Durante el proceso de final de telofase, se puede observar la citocinesis, por estrangulamiento en

células animales o por formación de un fragmoplasto en células vegetales.

Objetivo

Con esta práctica observaremos células en distintas fases de la división por mitosis en la raíz de la cebolla. 

Materiales utilizados

Cebolla, vaso con agua, palillos, tijeras, mechero, vidrio de reloj, orceína A y B y microscopio óptico. 

Procedimiento

·         Dejaremos un bulbo de cebolla durante varios días con las raíces en agua. Para ello, colocamos en el bulbo tres o cuatro palillos, de manera que sólo las raíces toquen el agua colocada en un vaso.

·         Pasados varios días las raíces crecerán. Cuando tengan, más o menos, cuatro centímetros de longitud cortaremos con tijeras los cuatro o cinco milímetros finales (es tejido meristemático, con división celular activa). En un vidrio de reloj colocaremos varios fragmentos cortados cubiertos con orceína A.

·         Calentamos los fragmentos con la orceína A al mechero hasta que aparezcan vapores. Son tóxicos, debemos tomar precauciones y no respirarlos. La temperatura no debe superar los 60 ºC, es decir, el vidrio de reloj no debe llegar a quemarnos.

·         Colocamos sobre un portaobjetos, con la ayuda de pinzas, dos o tres fragmentos de raíz y agregamos sobre ellos varias gotas de orceína B (es orceína A con unas gotas de ácido acético glacial).

·         Colocamos un cubreobjetos y secamos los bordes con papel de filtro.

·         Realizamos una presión ligera sobre el cubreobjetos para conseguir la extensión de las células. Observamos la preparación con el objetivo de 100 aumentos. Recuerda utilizar aceite de inmersión y limpiar el objetivo al terminar.

Vídeo sobre los símbolos de riesgo y pictogramas de los reactivos y productos utilizados en laboratorio.

Vídeo: Microscopio efecto tunel, nanotecnología.